Impact of phosphorylation of the C-terminal domain of TDP-43 on its self-assembly : implications in amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
Impact de la phosphorylation du domaine C-terminal de TDP-43 sur son autoassemblage : implications dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA)
Résumé
Protein aggregation is a feature of many neurodegenerative disorders, including amyotrophic lateral sclerosis (ALS). This disease is characterized by cytoplasmic accumulation of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), an RNA-binding protein, in patients' motor neurons. Unfortunately, there is no curative treatment for this devastating condition. In this study, we developed an automated in cellulo approach to quantify TDP-43 self-assembly in the cytoplasm using HeLa cell microtubules as nanoplatforms. To this end, we combined the High Content Screening Microscope (HCS) and the Microtubule Bench technique, already patented by the SABNP laboratory, to reconstitute the cytoplasmic self-assemblies of TDP-43, depending on the phosphorylation state of its C-terminal domain. We validated this automated approach by assessing the impact of phosphomimetic mutations on TDP-43 self-association. Our results showed that C-terminal hyper-phosphorylation promotes reduced cytoplasmic self-assembly and reduced recruitment of TDP-43 to stress granules (GS) under conditions of acute arsenite stress. In contrast, under mild stress conditions, TDP-43 recruitment to GS is independent of phosphorylation. Our experiments revealed, for the first time, A first screening test identified 16 hit compounds, including 14 kinase inhibitors that reduce TDP-43 phospho-dependent self-assembly, and 2 phosphatase inhibitors that have the opposite effect. We selected 13 compounds for further in cellulo screening in HeLa and NSC-34 cells. We obtained a clear correlation between the effect of the compounds on TDP-43 cytoplasmic self-assemblies and on TDP-43 nucleocytoplasmic transport. Indeed, our results demonstrate that selected kinase inhibitors negatively regulate nuclear levels of wild-type TDP-43, while the opposite is observed with selected phosphatase inhibitors. Our results also demonstrated that kinase inhibitors disrupt the nuclear mport of the wild-type form of TDP-43, which is also the case for the hypo-phosphorylated form of TDP-43 under untreated conditions. Finally, we found that the hypo-phosphorylated form of TDP-43 promotes cytoplasmic self-assemblies of TDP-43 in the cytoplasm, which could explain the cytoplasmic accumulation and loss of nuclear import. In conclusion, our studies suggest that reducing TDP-43 cytoplasmic self-assemblies, by modulating the phosphorylation state of its CTD domain, could be a promising strategy to restore the presence of a phosphorylation status on the subcellular localization of TDP-43. Phosphorylation of TDP-43 tends to retain the protein in the nucleus, while hypo-phosphorylation promotes cytoplasmic accumulation of TDP-43. Once we had identified the phenotypes associated with phosphorylation, we attempted to correct them with small molecules. To this end, we developed a screening platform and screened 134 compounds from a commercial library, including 98 kinase inhibitors and 36 phosphatase inhibitors. TDP-43 nuclear localization in ALS and other TDP-43-associated proteinopathies. Our results open new prospects for high-throughput screening to identify compounds targeting TDP-43 and its self-assembly. This will contribute to the development of targeted therapies aimed at alleviating the pathological manifestations associated with cytoplasmic accumulation of TDP-43.
L’agrégation des protéines est une caractéristique de nombreux troubles neurodégénératifs, y compris la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cette maladie se caractérise par l’accumulation cytoplasmique de TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), une protéine de liaison à l’ARN, dans les motoneurones des malades. Malheureusement, il n'existe actuellement aucun traitement curatif pour cette affection dévastatrice. Dans cette étude, nous avons développé une approche in cellulo automatisée afin de quantifier l’autoassemblage de TDP-43 dans le cytoplasme en utilisant les microtubules des cellules HeLa comme nanoplateformes. Pour cela, nous avons combiné le microscope à haut contenu (HCS) et la technique du Microtubule Bench, déjà breveté par le laboratoire SABNP, afin de reconstituer les autoassemblages cytoplasmiques de TDP-43, en fonction de l’état de phosphorylation de son domaine C-terminal. Nous avons validé cette approche automatisée en évaluant l’impact de mutations phosphomimétiques sur l’autoassociation de TDP-43. Nos résultats ont permis de montrer que l’hyper-phosphorylation C-terminale, favorise la réduction des autoassemblages cytoplasmiques ainsi que la diminution du recrutement de TDP-43 dans les granules de Un premier test de criblage a permis d’identifier 16 molécules hits, dont 14 inhibiteurs de kinases qui réduisent les autoassemblages phospho-dépendants de TDP-43, et 2 inhibiteurs de phosphatases qui ont l’effet inverse. Nous avons sélectionné 13 composés afin de réaliser des tests de criblage in cellulo supplémentaires sur des cellules HeLa et NSC-34. Nous avons obtenu une corrélation claire entre l’effet des composés sur les autoassemblages cytoplasmiques de TDP-43 et sur le transport nucléo-cytoplasmique de TDP-43. En effet, nos résultats démontrent que les inhibiteurs de kinases sélectionnés régulent négativement les niveaux nucléaires de la forme sauvage de TDP-43, tandis que l’inverse est observé avec les inhibiteurs de phosphatases sélectionnés. Nos résultats ont également démontré que les inhibiteurs de kinases perturbent l’import nucléaire de la forme sauvage de TDP-43, ce qui est également le cas pour la forme hypo-phosphorylée de TDP-43 en conditions non-traitée. Enfin, nous avons constaté que la forme hypo-phosphorylée de TDP-43 favorise les autoassemblages cytoplasmiques de TDP-43 dans le cytoplasme, ce qui pourrait expliquer l’accumulation cytoplasmique et la perte de l’importation nucléaire. En conclusion, stress (GS) en conditions de stress aigu de type arsénite. En revanche, en conditions de stress léger, le recrutement de TDP-43 dans les GS est indépendant de la phosphorylation. Nos expériences ont permis de mettre en évidence pour la première fois, un effet de l’état de phosphorylation sur la localisation subcellulaire de TDP-43. La phosphorylation de TDP-43 a tendance à retenir la protéine dans le noyau tandis que l’hypo-phosphorylation favorise l’accumulation cytoplasmique de TDP-43. Une fois les phénotypes associés à la phosphorylation identifiés, nous avons tentés de les corriger avec des petites molécules. Pour cela, nous avons mis au point une plateforme de criblage, et cribler 134 composés issus d’une librairie commerciale dont 98 inhibiteurs de kinases et 36 inhibiteurs de phosphatases. nos études suggèrent que la réduction des autoassemblages cytoplasmiques de TDP-43, en modulant l’état de phosphorylation de son domaine CTD, pourrait constituer une stratégie prometteuse pour restaurer la localisation nucléaire de TDP-43 dans la SLA et dans d’autres protéinopathies associées à TDP-43. Nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives de criblage à haut débit afin d’identifier des composés ciblant TDP-43 et son autoassemblage. Cela contribuera au développement de thérapies ciblées visant à atténuer les manifestations pathologiques associées à l’accumulation cytoplasmique de TDP-43.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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